王西阁王晓格胡姬婷（郑州大学第三附属医院郑州450052）【摘要】目的研究CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Tregs)及转化生长因子-β1（TGF-β
1）在再障患儿外周血中的表达水平，探讨其在再障发病机制中的作用。方法采用流式细胞术分别检测21例慢性再障(CAA)、9例急性再障(SAA)和15例正常健康儿童外周血Tregs细胞的比例变化，并用酶联免疫吸附法（ELISA）检测其外周血TGF-β1表达水平。结果再障患儿外周血中CD4+T细胞百分比、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127lowTregs细胞占CD4+T细胞百分比及血清TGF-β1表达水平均低于正常对照组（p﹤0.05），急性、慢性再障患儿相比，SAA组低于CAA组（p﹤0.05）；再障患儿CD4+CD25+CD127lowTregs细胞百分数与TGF-β1的表达水平无明显相关性。结论再障患儿外周血调节性T细胞比例减少，血清TGF-β1表达水平减低，可能参与了再障的发病，且SAA表达低于CAA，可作为判断再障严重程度的一项指标。关键词：再生障碍性贫血；调节性T细胞；流式细胞术；转化生长因子-β1TherolesofCD4+CD25+CD127lowregulatoryTcellsandrelatedcytokinesinthepathogenesisofaplasticanemiainchildrenWangXi-GeWangXiao-GeHuJi-Ting(theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)AbstractObjective:TostudyonthelevelsofCD4+CD25+CD127lowregulatoryTcells(Tregs)andTGF-β1inperipheralbloodofaplasticanemiainchildren,andtoinvestigatetheroleofTregsinthepathogenesisofaplasticanemia.Methods:21patientswithchronicaplasticanemia(CAA),9patientswithacuteaplasticanemia(SAA)and15normalhealthychildrenwereincludedinthisstudy.TheproportionofCD4+CD25+CD127lowTcellspopulationinCD4+Tcellswasevaluatedbyflowcytometricanalysis.TGF-β1wasmeasuredbyELISA.Results:ThepercentageofperipheralbloodCD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25+CD127lowTcellsandserumTGF-β1expressioninpatientswithAAwerelowerthanthenormalcontrol(p﹤0.05).SAAcomparedtopatientswithCAA,SAAwaslowerthanCAA(p﹤0.05).AplasticanemiainchildrenwithCD4+CD25+CD127lowTcellpercentageandexpressionofTGF-β1levelwerenosignificantcorrelation.Conclusion:ThelowpercentageofregulatoryTcellsandexpressionofTGF-β1levelinAApatientsmaybeinvolvedinpathophysiologyofAA,especiallyinpatientswithSAA,whichcouldbeusedasanindicatoroftheseverityofaplasticanemia.【Keywords】:Aplasticanemia;CD4+CD25+Tregs;FlowCytometric;TGF-β1再生障碍性贫血(aplasticanemia,AA)简称再障，是由于骨髓造血衰竭导致全血细胞生成减少的一种获得性疾病；研究发现免疫系统紊乱与再障的发生密切相关，多数再障是T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病1。因此，深入研究再障患儿的免疫功能有利于新的免疫治疗策略。近年来发现，CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryTcells,Tregcells)是具有维持自身免疫自稳作用的T细胞亚群，在自身免疫病中的作用逐渐成为研究热点，其分泌的转化生长因子(TGF-β1)等细胞因子可能发挥了重要作用2。但有关Tregs细胞在再障发病中的作用目前尚不清楚，我们通过研究再障患儿外周血Tregs细胞及相关细胞因子TGF-β1的水平，探讨其在再障发病中的可能作用。1资料和方法1.1研究对象收集我院及郑大一附院2008年6月-2009年6月住院及门诊再障患儿30例，诊断标准参考小儿再障诊疗建议3，其中慢性再障（CAA）患儿21例，男13例，女8例，中位年龄5.5（2-14）岁，急性再障（SAA）患儿9例，男6例，女3例，中位年龄6（3-1
2）岁，既往均未输血及免疫抑制治疗；同期我院儿童保健中心正常体检儿童15例，男10例，女5例，中位年龄6（3-14）岁，各组之间性别、年龄无差异，具有可比性。1.2标本采集所有再障患儿及健康儿童均于清晨空腹抽取外周静脉血5ml，其中3ml用EDTA抗凝，6小时内流式细胞术分析，2ml用干燥管分离出血清，保存于-80℃，用于ELISA检测。1.3主要试剂荧光鼠抗人CD4-FITC，CD25-APC，CD127-PE单克隆抗体，阴性对照鼠抗人IgG1-FITC，IgG1-APC，IgG1-PE均购自美国BectonDickinson（BD)公司；FACSCalibur流式细胞仪为美国BectonDickinson（BD)公司产品。人TGF-β1定量ELISA试剂盒(进口分装)购自上海森雄生物科技有限公司。1.4流式细胞术检测外周血CD4+CD25+CD127lowTregs细胞应用荧光免疫直接标记法及FCM检测外周血CD4+CD25+CD127lowTregs细胞。流式管中各加入100μl抗凝全血，然后每管中分别加入不同荧光标记的单克隆抗体(mAb)10μl，同型对照分别为IgG1-FITC，IgG1-APC，IgG1-PE，振荡混匀，室温避光孵育20min后，每管各加入2ml的红细胞裂解液（本实验室配制），振荡混匀，室温避光10min，1000r/min离心5min，弃上清液，加入PBS液1ml，1000r/min离心5min，弃上清液，加入PBS液0.5ml混匀后，应用FACSCalibur流式细胞分析仪上机检测，每管标本采集105个细胞进行分析，分析软件使用美国BectonDickinson公司提供的Cellquest软件，先以前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定淋巴细胞群，再以CD4+T细胞设门，分析CD4+T细胞上CD25与CD127的表达，计算CD4+CD25+CD127lowT细胞的百分比。1.5TGF-β1表达水平检测应用双抗体夹心ELISA方法，严格按试剂盒说明进行操作，建立标准曲线，酶标仪上读取吸光度（OD）值，490nm为TGF-β1值，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，建立标准曲线，根据血清样品的OD值，应用CurveExpert1.3软件分析其浓度值。1.6统计学处理采用SPSS12.0统计软件分析，数据用(`c±s)表示，以单因素方差分析进行多组间比较，组间比较采用LSD法，关联分析用线性相关分析。2．结果2.1再障患儿外周血Tregs细胞的表达水平与正常对照组相比，急、慢性再障患儿外周血CD4+T细胞、CD4+CD25+及CD4+CD25+CD127low占CD4+T细胞的百分比均降低(p＜0.05），而SAA组低于CAA组(p＜0.05)。见表1。2.2外周血TGF-β1的表达水平急、慢性再障患儿组TGF-β1表达水平分别为（10.72±3.35）和（18.26±5.05）ng/ml(p＜0.05)，两组与正常对照组（36.88±6.41）ng/ml相比均明显降低（p＜0.01）。见表1。2.3再障患者外周血CD4+CD25+CD127lowTregs与TGF-β1表达水平的相关性分析再障患儿外周血CD4+CD25+CD127lowTregs百分数与TGF-β1表达水平无明显相关性。（r=0.136，p﹥0.05）。表1再障与正常儿童外周血Tregs(%)和TGF-β1(ng/ml)的表达水平比较（`c±s）组别nCD4+CD4+CD25+CD4+CD25+CD127lowTGF-β1对照组1536.86±3.226.99±0.456.41±0.5136.88±6.41SAA925.94±4.13b3.41±0.21a1.48±0.42a10.72±3.35bCAA2131.41±3.81*5.16±0.41*2.57±0.45**18.26±5.05**注：*p﹤0.05vs对照组，**p﹤0.01.ap﹤0.05vsCAA组，bp﹤0.01.讨论再生障碍性贫血是血液系统常见的疾病，目前病因与发病机制尚未明确，但是有关再障的“免疫介导”发病机制，目前国内外已经基本达成共识，认为细胞免疫异常在再障的发病中起到极为重要的作用。自Sakaguchi等在1995年4首先发现在正常人和小鼠外周血的CD4+T细胞中有一亚群细胞持续高表达CD25分子(IL-2受体α链)，即CD4+CD25+调节性T细胞(regulatoryTcells,Tregcells
标签：再障,调节性,CD4
