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游戏开始前需要确定主角的名字，这里就使用默认的Desmond。游戏开始是一段关于前两部《刺客信条》的回忆。动画之后，古代的主角Ezio身处一场战斗之中。根据系统提示不断按鼠标左键，攻击敌人的首领。但是最后还是会被他躲开。接着镜头会切换。
1499年12月 IL Vaticano
按WASD控制角色的移动。控制角色朝前走，在前面金属杖那边会有动画。平台降了下去，同时主角的叔叔出现。按E键进入EAGLE VISON，就可以看到发光的指示物。跑过去，然后按住鼠标右键和空格键，还有方向键就可以爬上去。爬上去后按WASD来移动，向上爬。
爬上去后，一路跟着叔叔前进。按住鼠标右键可以跑动，按住SHIFT键可以推开路上的人群。
从屋子里面出来后会开始遇到敌人，按鼠标左键攻击，按住鼠标右键进行格挡。
然后一路跟着Mario叔叔前进。按住鼠标右键和空格键可以快速跑动或跳跃，攀爬。注意从高处跳下是会少血的，跳进草堆中就没事了。同时还需要干掉路上出现的敌人。
最后两人爬上了河边一幢房子的塔顶，然后跳入河中离开。
1500年1月 Monteriggioni
Ezio骑着马跟随叔叔回家乡的城镇。进入城里后，来到主角的家中。
Ezio与妹妹相见后，需要先去完成3个小任务然后再回家。右下方的小地图中会有3个感叹号的可接任务标记。一个任务是帮助妇女搬花，按E键对话。接着按Shift键搬起花之后跟着妇女到达指定地点。
第二个任务在城外，帮助找回马匹。快速跑向马匹，然后快速按Shift键上马，接着骑马回去交任务。
最后一个小任务是在城墙上，可以跳到屋顶上再爬到城墙上，或者通过任务点附近的梯子上去。和炮台边的NPC对话后去蓝色标记点的修理工对话后再回到炮台那里。在修理好大炮后，按Shift键使用大炮。用鼠标控制准星然后按鼠标右键射击。干掉小地图上表示的所有红色标记点。
完成3个小任务后，回到家中与Caterina还有母亲，妹妹见面。按Shift键可以开门。动画之后，上楼进主角自己的房间休息。
第二天早上，小城受到敌人的攻击。Eizo从家中出来骑上马向绿色比标记的炮台骑去。
半路会从马上跳下来，继续向炮台前进。通过标记点的梯子那里上去。
上去后使用大炮炸毁敌方的火炮。需要先后使用左右两门大炮。
敌人的箭楼冲到的城墙边，大量敌人涌到了城墙上。向右边出现的敌人那里跑过去，爬到箭楼上面，根据提示换武器，然后按F键锁定下面的敌人，接着按鼠标左键跳下去杀死他。
干掉城墙上的所有敌人。此时Ezio的叔叔和Caterina都被抓住。
从城墙上下来带着同伴回家营救母亲和妹妹，干掉路上出现的敌人。此时Ezio受了伤，所以血量上限会减少。
救了妹妹之后跟着她去救母亲。然后进入家中的密道逃离小城。
从城里出来后，Ezio让妹妹带着母亲前往佛罗伦萨，而自己骑马前往罗马，但是由于受伤而在中途落马。第一章结束。
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